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您的位置:首頁>儀器儀表資訊>實驗室動態> 遺傳發育所開發出高精準胞嘧啶堿基編輯工具

遺傳發育所開發出高精準胞嘧啶堿基編輯工具

發布時間:2020/7/29編輯:Ma Liang 人氣:2772

  【阿儀網 實驗室動態】堿基編輯技術是基于CRISPR系統開發的基因組定向修飾技術。該技術由于不需要DNA雙鏈斷裂和外源供體DNA可以實現對目的堿基的精準替換,在疾病治療、植物性狀改良等方面具有很大應用潛力。中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞研究組長期致力于植物基因組編輯技術的創新及應用研究,前期已經在植物中建立了完善的胞嘧啶堿基編輯器(CBE)和腺嘌呤堿基編輯器(ABE)技術體系,但是發現胞嘧啶堿基編輯器在基因組水平存在脫靶效應。為解決這一問題,高彩霞研究組通過對人類胞嘧啶脫氨酶(APOBEC3B)蛋白的理性設計,并結合新型的胞嘧啶堿基編輯篩選方法,開發出了新型高精度、高編輯活性的胞嘧啶堿基編輯工具。

  研究人員首先在水稻原生質體中建立并優化了基于R-loop的高通量堿基編輯器特異性評估方法。該方法利用CBE作用于單鏈DNA的特性,通過SpCas9的正交蛋白nSaCas9在編輯靶點外的基因組區段誘導R-loop,從而人為制造單鏈DNA(ssDNA)區域。如果CBE的脫氨活性在這些區域產生脫靶編輯,可以通過高通量測序進行富集檢測。該工作首先對已報道的5個胞嘧啶堿基編輯器分別通過R-loop方法和全基因組測序(WGS)進行特異性檢測,發現R-loop方法與WGS的結果一致,證明了R-loop方法的可靠性。且該方法與WGS相比,更加快速、便捷和經濟。

  在此基礎上,研究人員對一系列理性設計的基于人源APOBEC脫氨酶的CBE的特異性進行篩選。他們以編輯效率高且編輯窗口小的A3Bctd作為蛋白進化的原始底盤,根據蛋白結構信息預測與其脫氨的催化活性和ssDNA結合能力相關的結構域以及這些結構域中的重要氨基酸殘基,通過理性設計獲得16個單氨基酸替換的CBE變體。通過篩選獲得了靶向效率維持較高且能較顯著降低脫靶效應的7種單個氨基酸突變(R211K, T214V,, R311K, Y313F, D314R, D314H 和 Y315M)。為了進一步降低CBE的脫靶效應,研究人員將這些單氨基酸突變進行組合創制了9個多氨基酸替換變體,最終篩選得到了兩種靶向編輯效率較高且特異性顯著增加的CBE變體:A3Bctd-VHM-BE3和A3Bctd-KKR-BE3。對編輯產物的分析顯示,這兩種變體在編輯窗口內主要產生單個C或者兩個C的替換,顯著提升了編輯精確性。最后,通過對150個水稻編輯植株的全基因組測序數據進一步證明了A3Bctd-VHM-BE3和A3Bctd-KKR-BE3的高特異性。

  該工作結合基于結構信息的蛋白理性設計、植物個體全基因組脫靶檢測技術和高通量R-loop脫靶檢測技術,進一步提高了單堿基編輯的精確性,開發出的兩種能保持高編輯效率且無隨機脫靶效應的CBE變體,為基因治療和植物分子設計育種提供了有力工具支撐。

微信號:ayiwangapp17

(來源: 中國科學院科技產業網 )

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